Ein einziges Molekül als Krankheitserreger, gibt's das? In Ausgabe 12 habe ich schon ein Protein als mutmaßliches krankmachendes Molekül vorgestellt, das Prion-Protein, der Erreger des Rinderwahnsinns und anderer, auch den Menschen betreffende, Gehirnerkrankungen. Allerdings ist noch nicht zweifelsfrei erwiesen, daßallein das Prionprotein die Krankheiten verursacht. Als Gegenpart zu den Prionen gibt es im Pflanzenreich einen Krankheitserreger, dessen Bestandteil zweifelsfrei ein einziges Molekül darstellt. Allerdings handelt es sich hierbei nicht um ein Polypeptid, sondern um ein zirkulär geschlossenes, einzelsträngiges Ribonukleinsäure-Molekül.
Die Ribonukleinsäure (RNS, engl. RNA) entsteht in Zellen beim Ablesen der Erbinformation durch sogenannte RNA-Polymerasen. Die Erbinformationen von Zellen bestehen aus den Desoxyribonukleinsäuren (DNS, engl. DNA), die als Doppelstrang helixartig umeinander gewunden sind. Einer der Doppelstränge dient der RNA-Polymerase als Matrize für die Herstellung des RNA-Moleküls. Die DNA unterscheidet sich von der RNA nur durch das Fehlen eines Sauerstoffatoms am Ribosemolekül (deshalb Desoxyribo...) und eine der Basen enthält eine zusätzliche Methylgruppe (Thymin, bei der RNA heißt diese Base Uracil). Das Viroid geht an vielen Stellen Basenpaarungen ein, deshalb kann dieses Nukleinsäuremolekül seine charakteristische, stäbchenförmige Gestalt annehmen (Abb. 3).
Entdeckung der ViroideEs gab eine Reihe von rätselhaften Pflanzenkrankheiten (s. Abb. 1 u. 2), deren Erreger sich einfach nicht identifizieren ließen, so daß man sich in den sechziger Jahren daran machte, Licht in das Dunkel dieser ominösen Erkrankungen zu bringen. Zu diesen Krankheiten gehörten unter anderen die Spindelknollensucht der Kartoffel und die Citrus-Exicortis-Krankheit. Als Krankheitssymptome zeigten sich Nekrosen, Chlorosen, Zwergwuchs u.a. Übertragen werden konnten diese Krankheiten durch Blattberührungen und durch Arbeiten mit Kulturgeräten, so daßalles auf einen viralen Erreger hindeutete.
Abb. 1: Das Foto zeigt ganz rechts eine gesunde Tomatenpflanze, die anderen sind mit Viroiden infiziert und zeigen starke Wachstumsstörungen. Foto: Institut für Physikalische Biologie, HHU Düsseldorf.
Ende der sechziger Jahre war bereits bekannt, daßvirale Infektionen auch durch hüllenlose Virus-Nukleinsäuren hervorgerufen werden können. Verschiedene biologische Tests zeigten dann auch hier eindeutig, daßnur freie RNA als Erregertyp in Frage kommt (bei Viren kommt auch RNA als Träger der Erbinformation vor, nicht so bei "richtigen" Lebewesen). Nach der ersten Anreicherung des Erregers stellte man dann allerdings erstaunt fest, daßdieser eine relative Molekülmasse von nur 25.000 bis maximal 150.000 haben konnte. Das Genom von RNA-Viren hat gewöhnlich eine relative Molekülmasse von mehr als 1.000.000, so daß ein neuer Begriff für diese Partikel geprägt wurde: Viroid (virusähnlich). Entdeckt wurde das ganze etwa gleichzeitig und unabhängig voneinander Anfang der siebziger Jahre gleich von vier Arbeitsgruppen: T. O. Diener, Beltsville, USA; H. L. Sänger, Gießen; J. S. Semancik, Riverside, USA und R. P. Singh, Fredericton, Kanada.
Als man die Nukleinsäuresequenzen vieler Viroide bestimmt hatte, zeigten sich einige Regularitäten in der Basenabfolge und der Struktur. Besonders zeichnete sich die dann so getaufte "Zentrale Konservierte Region" (eng. CCR) durch große Homologitäten aus.
NachweisverfahrenDie Diagnose einer Viroid-Krankheit erfolgt meist durch den direkten Nachweis der Viroid-RNA in Nukleinsäureextrakten infizierter Pflanzen mittels Gelelektrophorese oder über bioassays an geeigneten Wirtspflanzen (indirekter Nachweis). Bei der Gelelektrophorese macht man sich die bereits erwähnte stäbchenförmige Gestalt der Viroide zunutze. Zunächst wird ein Nukleinsäureextrakt aus Blättern mutmaßlich infizierter Pflanzen hergestellt, der alle RNA-Moleküle enthält. Dieser Extrakt wird zuerst in einem nativen, d. h. die Struktur der RNA nicht ändernden, Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgt nach Größe und Form der RNA-Moleküle. Da die Viroide eine stäbchenförmige Gestalt haben, laufen sie schneller durch das Gel als einzelsträngige oder verzweigte RNA-Moleküle gleicher Größe.
Abb. 2: Das Foto zeigt links normale, gesunde Kartoffeln, rechts sieht man die typisch spindelförmigen Kartoffeln, die mit PSTVd infiziert sind. Foto: Institut für Physikalische Biologie, HHU Düsseldorf.
Mit anderen Worten: An der Stelle im Gel, an der sich die Virode befinden, gibt es noch andere RNA-Moleküle, die kleiner sind. Um diese von den Viroiden abzutrennen, wird die entsprechende Gelbahn ausgeschnitten und, um 90°verdreht, in ein neues Gel einpolymerisiert (Abb. 4A u. B). Dieses Gel ist diesmal denaturierend, alle Strukturen der Nukleinsäuren werden aufgelöst. Die normalen Zell-RNA-Moleküle liegen dann als Einzelstrang vor, die Viroid-Moleküle als RNA-Ring. Dieser Ring läuft nun aufgrund seiner Form erheblich langsamer durch das Gel als ein gestrecktes RNA-Molekül gleicher größe. Da die RNA-Moleküle, die sich an derselben Stelle wie die Viroide befinden, auch noch kleiner sind als die Viroide, verstärkt sich der Effekt: Die Viroide bleiben deutlich zurück und werden gut sichtbar abgetrennt (s. Abb. 4C). Dieses und andere Verfahren kann man übrigens persönlich im Biophysik-Großpraktikum ausprobieren.
Replikation und ProzessierungEin zentrales Thema der Viroid-Forschung war und ist die Aufklärung des Vermehrungsmechanismus, auch Replikation genannt. Hierbei tritt ein ganz spezielles Problem auf, denn zur Vermehrung mußdie Viroid-RNA von einer Polymerase abgelesen werden, die dann entsprechend der Sequenz einen komplementären Strang herstellt. Die infizierten Zellen besitzen aber keine Enzyme zur Synthese von RNA nach Vorlage einer RNA-Matrize; alle RNA-Moleküle werden nach DNA-Matrizen hergestellt. RNA-Viren besitzen deshalb die genetische Information für Enzyme, die entweder RNA nach RNA-Matrizen herstellen (RNA-abhängige RNA-Polymerase) oder die DNA nach RNA-Matrizen herstellen (RNA-abhängige DNA-Polymerase).
Abb. 3: Zweidimensionale und perspektivische Sekundärstruktur des Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd). Die Nukleotide der Zentralen Konservierten Region (CCR) sind fett gedruckt.
Das Genom der Viroide ist mit nicht einmal 400 Nukleotide für solcherlei Enzyme jedoch zu klein. Die Replikation mußdeshalb vollständig durch das Enzymsystem der Wirtszelle katalysiert werden. Mittlerweile konnte die Beteiligung der DNA-abhängigen RNA-Polymerase II an der Replikation der Viroide durch Inhibitionsexperimente bewiesen werden.
Abb. 4
A) Natives Gel für den RNA-Extrakt. Die bahn wird ausgeschnitten und in Gel B einpolymerisiert.
B) Denaturierendes Gel zum Abtrennen des Viroids. Die Laufrichtung wird aus technischen gründen von unten nach oben gewählt.
C) Gel B nach der Elektrophorese, das Viroid wurde abgetrennt. (Weitere Erläuterungen im Text)
Dies ist natürlich sehr erstaunlich, da diese Polymerase eigentlich nur DNA als Matrize verwenden kann. Wieso auch Viroid-RNA akzeptiert wird, ist bis jetzt ein Rätsel. Aufgrund experimentell isolierter monomerer und oligomerer Transkriptionsprodukte nimmt man für die Replikation einen "Roling circle-Mechanismus" an (s. Abb. 5).
Abb. 5: Roling circle-Mechanismus der Replikation des Potato Spindle Tuber Viroid. Erläuterungen im Text.
Dabei wird das ringförmige Viroid-Molekül in oligomere (-)-Stränge umgeschrieben, die dann als Matrize für die Synthese von oligomeren (+)-Strängen dient. Die (+)-Stränge werden enzymatisch in monomere Einheiten zerschnitten und mit ihren Enden verbunden; damit sind neue Viroide entstanden. Diesen Vorgang nennt man Prozessierung. Für die Prozessierung der oligomeren (+)-Stränge zu reifen Viroiden wird eine übergeordnete Struktur favorisiert, die sich unter Beteiligung der Zentralen Konservierten Region (CCR) und umliegender Sequenzen aus mehreren units (Einheitslängen) zusammensetzt. In vitro funktioniert das Schneiden und das Verbinden (Legieren) der Enden mit nur einem Enzym, der RNase T1, welche aus dem Pilz Aspergillus oryzae stammt.
Strukturelle Voraussetzungen der ProzessierungDamit das Legieren zu einem ringförmigen Molekül geschehen kann, müssen die beiden Schnittstellen sich in unmittelbarer räumlicher nähe zueinander befinden; dies setzt eine bestimmte Prozessierungsstruktur voraus. Zur Bestimmung dieser Struktur wurden zunächst Computerberechnungen am kleinsten nichteinheitslänge PSTVd-Molekül durchgeführt, in dem zweimal die Schnittstelle G80/C81 vorkommt. Als thermodynamisch am günstigsten wurde eine trihelikale Struktur im Schnittstellenbereich ermittelt, die nur durch zwei kleine Loops unterbrochen ist und 28 Basenpaare zählt (s. Abb. 6).
Der Nachweis dieser Struktur als Prozessierungsstruktur sollte über Temperaturgradienten-Gelelektrophoresen (TGGE, s. Kasten 1) und die Prozessierbarkeit mit RNase T1 geführt werden. Hierzu wurden 15 Mutanten hergestellt, die alle die Stabilität der trihelikalen Struktur beeinflußten. Von diesen 15 Mutanten und dem Wildtyp-PSTVd wurde das Denaturierungsverhalten in der TGGE unter verschiedenen Ionenkonzentrationen bei vorangehenden Renaturierungen sowie deren Prozessierbarkeit mit der RNase T1 bestimmt. Zudem wurde für alle Mutanten die optimale Sekundärstruktur berechnet. Hierbei ergaben sich zusätzlich zur trihelikalen Struktur drei grundsätzlich andere Strukturen: die EL- (extended left), EM- (extended middle) und ER- (extended right) Struktur. Nach Abschlußder Experimente zeigte sich, daßdie Prozessierbarkeit nur dann gegeben ist, wenn die EM-Struktur in der TGGE sich als dominant erwies, d. h. die trihelikale Struktur ist nicht, wie ursprünglich postuliert, die Prozessierungsstruktur
(s. Kasten 2).
Pathogenität und InfektiositätEin wichtiges Ziel der heutigen Viroid-Forschung ist die Aufklärung der Pathogenität und der Infektiösität. Bislang weiß man so gut wie nichts über die krankmachenden Aktivitäten des Viroids in seiner Wirtszelle. Auch weiß man nur sehr wenig über den Ausbreitungsmechanismus in der Wirtspflanze. Durch gezielte Mutationen von bestimmten Viroidsequenzen ist es aber gelungen, die Ausbreitung der so veränderten Viroide in der Pflanze stark einzuschränken oder die krankmachenden Eigenschaften abzuschwächen bzw. ganz auszuschalten. Man kennt also bestimmte Regionen im Viroid, die für die Infektiösität und die Pathogenität verantwortlich sind, aber welche Mechanismen dahinterstecken, weiß man bis heute nicht.
Danksagung:
Für die freundliche Bereitstellung von Literatur und Bildmaterial bedanke ich mich bei Professor Detlev Riesner und Andreas Fels vom Institut für Physikalische Biologie, HHU Düsseldorf.REFERENZEN
A. D. Branch and H. D. Robertson: "A Replication Cycle for Viroids and Other Small Infectious RNAs", Science B., 1984, 223, 450 - 455.
T. O. Diener: "Viroid processing: A model involving the central conserved region and hairpin I", Proc Not I Accd Sci USA 83, 1986, 58 - 62.
G. Steger, M. Tabler, W. Brüggemann, M. Colpan, G. Klotz, H. L. Sänger and D. Riesner: "Structure of viroid replicative intermediates: physio-chemical studies on SP6 transcripts of cloned oligomeric potato spindle tuber viroid", Nucleic Acids Research, 1986, V. 14, Nº24.
M. Tsagris, M. Tabler and H. L. Sänger: "Ribonuclease T1 generates circular RNA molecules from viroid specific RNA transcripts by cleavage and intramolecular ligation", Nulcleic Acids Research, 1991, V. 19, Nº7.
R. A. Owens and R. W. Hammond: "Mutational analysis of viriods", siminars in VIROLOGY, 1990, 1, 101 - 106.
G. Steger, T. Baumstark, M. Mörchen, M. Tsagris, H. L. Sänger and D. Riesner: "Structural Requirements for Viroid Processing by RNase T1", J. Mol. Biol., 1992, 227, 719 - 737.
T. O. Diener (Editor): "The Viroids", 1987, Plenum Press, New York.
D. Riesner: "Viroide - die kleinsten infektiösen Krankheitserreger", Medizin in unserer Zeit, 1979, 5, 158 - 164.
H. Niesalla und D. Wilkens: "Viroid-Prozessierung", Zusammenfassung zum Literaturseminar âregulatorische und katalytische RNAs`, Institut für Physikalische Biologie in Düsseldorf, 1995.
KASTEN 1
Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE)
Die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese wurde im Rahmen einer Diplomarbeit im Institut für Physikalische Biologie an der HHU in Düsseldorf entwickelt. Sie dient der Analyse von Denaturierungsvorgängen bei Makromolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen. Sie ist ebenfalls dazu geeignet, Makromoleküle zu trennen, die sich nur durch ihr Denaturierungsverhalten unterscheiden. Bei der TGGE handelt es sich um eine Plattengelelektrophorese mit einer fast die gesamte Breite einnehmenden Geltasche, in die die Probe aufgetragen wird. Links und rechts davon befinden sich noch jeweils eine Geltasche, die zur Aufnahme der Probenmarker dienen. Quer zur Laufrichtung des Geles wird ein konstanter Temperaturgradient angelegt; in der Regel steigt die Temperatur von links nach rechts. Der Gradient wird mittels einer Aluminiumplatte hergestellt, an der sich links und rechts jeweils ein doppelter Temperierkanal befinden. An den Kanälen wird ein Kryostat bzw. ein Thermostat angeschlossen. Die gesamte Platte wird aus einem Stück angefertigt, so daßkeine Lötstellen vorhanden sind (Voraussetzung für einen gleichmäßigen Temperaturgradienten). Zur elektrischen Isolation ist die Platte mit einer Sinterschicht aus Polyamid umschlossen.
Praktisch geht man so vor, daßzunächst das Gel ohne Temperaturgradient gestartet wird, damit die Probe auf jeden Fall auf der gesamten Breite des Geles die Probentasche verläßt. Ist die Probe in ausreichendem Maße in das Gel gelaufen, so wird die Elektrophorese gestoppt, um den Temperaturgradienten anzulegen. Sobald sich der Gradient eingestellt hat, wird die eigentliche TGGE gestartet. Die Probe läuft nun bei unterschiedlichen Temperaturen durch das Gel; da der Gradient aber quer zur Laufrichtung eingerichtet ist, läuft jedes individuelle Molekül die gesamte Zeit über bei konstanter Temperatur.
Die TGGE wird hauptsächlich zur Analyse von Nukleinsäuren benutzt. Ab einer bestimmten Temperatur zeigen Nukleinsäuren Denaturierungserscheinungen; Basenpaarungen brechen auf, was meist von den Enden her geschieht, die Gestalt und somit das Laufverhalten ändern sich. DNA nimmt dabei zunächst eine Y-förmige Struktur an, die im Gegensatz zum kompletten Doppelstrang einen höheren Reibungswiderstand hat und somit langsamer läuft. Je höher die Temperatur ist, umso mehr Basenpaarungen brechen auf, umso langsamer laufen die Moleküle. Bei einer bestimmten Temperatur löst sich der Doppelstrang in zwei Einzelstränge auf, der Reibungswiderstand verringert sich wieder, die Einzelstränge laufen schneller. Es werden also zwei Übergänge durchlaufen, die beide hochkooperativ sind. Am Ende der TGGE zeigt die DNA im Gel einen schmelzkurvenähnlichen Verlauf, wobei der zweite Übergang irreversibel ist (sind erst einmal Einzelstränge entstanden, so finden sich diese im Gel nicht wieder); das bedeutet, daßdie Kurve hier abbricht und die Einzelstrang-DNA auf einer Front, weiter zur Anode hin, zu sehen ist. Da die Temperaturen, bei denen die beiden Übergänge stattfinden, unter anderem vom GC-Gehalt abhängig sind, hat jede DNA ihre eigenen Übergangstemperaturen (Tm 1 und Tm 2). Mit der TGGE lassen sich also einmal diese Übergangstemperaturen bestimmen, zum anderen können Gemische verschiedener, aber gleichlanger DNA-Stücke getrennt werden.
Struktur- und Mechanismusmodell für die Prozessierung von PSTVd-Transkripten durch die RNase T1.
Diese Ribonuklease schneidet das Viroid PSTVd jeweils zwischen den Nukleotiden Guanosin 80 und Cytosin 81, welche am linken Rande der Oberen Zentralen Konservierten Region (UCCR) liegen. Am C81 wird ein 5â-OH-Ende und am G80 ein 2',3'-Cyclophosphat gebildet. Die RNase T1 katalysiert auch die Rückreaktion, also die Ligation zum reifen Viroid und kann somit auch als "Zirkulase" bezeichnet werden.
Die Linien mit den Pfeilen markieren die potentiellen Binde- und Schnittstellen der RNase T1. Der Stern markiert ein zusätzlich inseriertes C84. Die fettgedruckten Nukleotide gehören zur CCR.
(a) zeigt das Transkript in der EM-Struktur mit den entsprechenden Bindestellen.
(b) Der Schnitt am 3' G80 induziert die Dissoziation des 3'-Terminus und ein Aufklappen des internen Loops, dadurch kann ein Teil des 5'-Endes mit der LCCR Basenpaarungen eingehen.
(c) Der Schnitt am 5' G80 und die Dissoziation des 5'-Terminus leitet die Ligation zwischen 3' G80 und 5' C81 ein.
(d) Das reife Viroid ist entstanden.
